Depois da sua aventura no Museu de História Natural, em Nova Iorque, o já famoso guarda-nocturno Larry Daley (Ben Stiller), transformou-se num inventor de sucesso, realizando assim o seu maior sonho. No entanto, e ao contrário do que seria de esperar, ele não está feliz. Na sua luta por uma carreira de sucesso, acabou por se esquecer de algo tão simples como o divertimento. Ao mesmo tempo, também os seus amigos do museu estão a passar um mau bocado. Uma reforma nas instalações levou a que fossem empacotados e enviados para os acervos do Museu Smithsonian, em Washington. Quando Larry recebe um telefonema desesperado de Jedediah (Owen Wilson), o cowboy miniatura, pedindo a sua ajuda contra um faraó tirano que pretende dominar o museu e o mundo, Larry não hesita e volta a vestir o uniforme que o fez viver a maior aventura da sua vida.